Сифилис является одной из самых известных и опасных венерических болезней. Сложно найти инфекцию, для лабораторных исследований которой применялся бы такой широкий спектр методов, как для сифилиса.
Лабораторное распознавание сифилиса отличается от диагностики других бактериальных инфекций тем, что, в отличие от многих патогенных микроорганизмов, Тreponema pallidum очень требовательна к составу искусственных питательных сред, и на обычных средах не размножается. Она растет на средах, содержащих почечную или мозговую ткань, в строго анаэробных условиях при температуре 35 °С.
Поэтому культивирование бледных трепонем на искусственных питательных средах возможно, но требует сложных специальных сред и анаэробной установки. При этом культуральные бледные трепонемы быстро теряют свою болезнетворность и меняют биологические (биохимические, физиологические) и морфологические свойства. Методы стабильного получения культур до настоящего времени отсутствуют.
Невозможность культивирования патогенных трепонем заставляет искать альтернативные методы определения микроорганизмов или антител к ним. Наряду с традиционными, открытыми в начале 20-го века, разрабатываются новые, более чувствительные и специфические методы. Эти методы должны удовлетворять следующим требованиям:
∎ высокая чувствительность и специфичность;
∎ соответствие метода исследования стадии и форме заболевания, а также распространенности инфекции в популяции;
∎ возможность получения объективных результатов и их прогнозирование;
∎ возможность автоматизации исследования, учета, архивирования и анализа полученных результатов;
∎ стандартизуемость процесса диагностического исследования, учета и анализа полученных результатов
Разработанные к настоящему времени методы лабораторной диагностики сифилиса можно классифицировать различным образом. Они могут быть разделены по различным критериям:
- прямые и непрямые (косвенные);
- тесты на антитела и прямые тесты на антиген;
- трепонемные (специфические) и нетрепонемные (неспецифические);
- отборочные (скрининговые), подтверждающие и диагностические;
- приборные и бесприборные.
Каждый вид тестов имеет свои преимущества и ограничения.
Прямые и непрямые методы дагностики сифилиса
Прямые тесты - это методы непосредственного выявления возбудителя в материале из очагов поражения. Прямые методы диагностики позволяют установить окончательный диагноз сифилитической инфекции, т.к. основаны на обнаружении T. pallidum в биологических образцах. Исследования проводятся с помощью темнопольной микроскопии и молекулярно-биологических методов (прежде всего ПЦР). Эти методы используются при наличии видимых сифилитических поражений.
Прямые методы используются для диагностики ранних форм заболевания, первичного и вторичного сифилиса с клиническими появлениями (эрозивно-язвенными элементами); для подтверждения врожденного сифилиса (для анализа используют ткань пуповины, плаценты, органы плода, отделяемое слизистой оболочки носа, содержимое пузырей, отделяемое с поверхности папул).
Прямые методы:
- микроскопия в темном поле (темнопольная микроскопия, ТПМ; dark field microscopy, DFM) и другие методы микроскопии;
- метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ; direct immunofluorescent assay, DFA)
- молекулярно-биологические методы детекции ДНК бледной трепонемы (полимеразная цепная реакция, ПЦР; polymerase chain reaction, PCR) и другие тесты на амплификацию нуклеиновых кислот (МАНК; nucleic acid amplification test, NAAT)
- ДНК-зондирование или гибридизация нуклеиновых кислот (ГНК) ;
- заражение кроликов инфицированным материалом от больных (rabbit infectivity test-RIT). Этот метод является старейшим, но в силу экономических, организационных трудностей, длительности в практике медицинских учреждений не используется.
Серологические (непрямые) методы дают возможность выявлять в крови больных или антитела, специфичные для определенного возбудителя инфекционного заболевания, или антигены (в большинстве случаев - белки) самих микроорганизмов. В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Методы серологической диагностики сифилиса базируются на выявлении антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови или в спинномозговой жидкости.
Серологические методы очень важны при диагностике сифилиса из-за того, что возбудитель сифилиса не культивируется на питательных средах in vitro, практически незаметен в «светлом поле» микроскопа, не окрашивается практически никакими стандартными лабораторными красителями и плохо сохраняется вне организма больного. Кроме того, в последние годы довольно часто наблюдается скрытое течение сифилитической инфекции, что затрудняет получение биологического материала, пригодного для прямой идентификации T. pallidum.
Трепонемные и нетрепонемные тесты
1. Нетрепонемные тесты служат для выявления антител к нетрепонемным антигенам.
Распространенные нетрепонемные тесты - это липидные (реагиновые) реакции. Эти тесты связаны не с определением антител против трепонемы, но с определением антител IgM и IgG к липоидным материалам из разрушенных клеток организма больного сифилисом. Чаще всего эти тесты применяются для скрининга из-за простоты и дешевизны. В них используется нетрепонемный кардиолипиновый антиген, а сами тесты проводятся в разных вариантах:
1) флокуляционные тесты (продукт реакции выпадает в виде хлопьев): микрореакции на стекле с липидными антигенами -экспресс-метод диагностики (микрореакции преципитации - РМП), VDRL (Venereal Disease Research Laboratory test), RPR (Rapid Plasma Reagin test) и др.;
2) реакция связывания комплемента (РСК) с липидными антигенами - реакция Вассермана (РСКк);
3) осадочные реакции, которые не используются в настоящее время (реакция преципитации Кана, цитохолевая реакция Закса - Витебского и др.).
2. Трепонемные тесты - выявление антител к трепонемным антигенам.
В трепонемных тестах чаще всего используются антигены Treponema pallidum, нативные (штамм Никольса) или рекомбинантные. Тест, в котором используются живые спирохеты - реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), в настоящее время выводится из клинической практики из-за дороговизны и сложности.
Групповые антигены являются общими для двух или более видов микробов, входящих в один род, а иногда относящихся и к разным родам. Специфические антигены имеются только у данного вида микроба или даже только у определенного типа либо подтипа внутри вида. Определение специфических антигенов позволяет дифференцировать микробы внутри рода, вида, подвида и даже типа (подтипа).
Реагиновые тесты используются для массового обследования пациентов на сифилис. Их обычно проводят в рамках профилактических осмотров. Такие тесты доступны в каждом лечебном учреждении и проводятся быстро. Ответ обычно готов спустя 30-40 минут.
Положительный результат при проведении реагиновых реакций не является критерием для постановки диагноза. Необходимо дополнительно провести видоспецифические исследования.
Самым распространенным скрининговым методом является реакция Вассермана. При ее проведении используются кардиолипиновый и трепонемный антигены. Если в сыворотке крови нет реагинов, то произойдет гемолиз эритроцитов барана, которые добавляются в качестве индикатора.
При наличии реагинов цельные эритроциты выпадут в осадок, в этом случае реакция считается положительной.
Реагиновые в следующих случаях:
- другие заболевания, возбудители которых по антигенной структуре схожи с бледной спирохетой
- беременность
- онкологические заболевания
- прием салицилатов
- инфаркт миокарда
- технические ошибки при проведении анализа
При положительном результате реагиновой реакции проводятся специфические серологические тесты. Также их назначает, если отрицательный результат вызывает сомнения.
Трепонемные антигены используются в таких анализах, как РИФ, РИТ, ИФА, РПГА, реакция гемадсорбции в твердой фазе. Эти реакции основаны на образовании комплексов антиген-антитело и различаются методикой их определения. Чаще всего используется реакция иммунофлюоресценции.
Препарат обрабатывается люминесцирующей сывороткой, что позволяет определить иммунные комплексы под люминесцентным микроскопом.
Одной из самых чувствительных серологических реакций, позволяющих диагностировать сифилис, является РПГА. Метод обладает высокой точностью. Его часто используется для верификации диагноза при беременности, когда другие анализы могут давать ложноположительный результат.
Особенности серодиагностики
Для проведения серологической диагностики сифилиса в разных его периодах производят забор крови из вены. Анализ рекомендуется проводить натощак, это снижает количество ложноположительных результатов. Пробирка должна быть стерильной. При проведении экспресс тестов в ряде случаев берут кровь из пальца.
При подозрении на для серодиагностики берут спинномозговую жидкость. Для ее анализа используются те же методики, что и при исследовании крови.
Для диагностики сифилиса пройдите полное обследование в нашей клинике.
При первичном сифилисе исследуется на бледную трепонему отделяемое твердого шанкра или пунктат лимфатических узлов. При вторичном сифилисе материал берется с поверхности эрозированных папул на коже, слизистых, с трещин и др. Перед взятием материала с целью очищения от различных загрязнений поверхность очагов (эрозии, язвы, трещины) необходимо тщательно протереть стерильным ватно-марлевым тампоном, который смачивается изотоническим раствором хлорида натрия или назначить примочки с этим же раствором. Очищенную поверхность осушивают сухим тампоном и платиновой петлей или лопаточкой слегка раздражают периферические участки, одновременно слегка сдавливая пальцами в резиновой перчатке основание элемента до появления тканевой жидкости (серума), из которой готовят препарат для исследования. Получение тканевой жидкости имеет важное значение для диагностики сифилиса, так как бледные трепонемы находятся в просветах лимфатических капилляров, в тканевых щелях вокруг лимфатических и кровеносных сосудов.Пункция регионарных лимфатических узлов
Кожу над лимфатическими узлами обрабатывают 96% спиртом и 3-5% спиртовым раствором йода. Затем 1 и 2 пальцами левой кисти фиксируют лимфатический узел. Правой рукой берут стерильный шприц с несколькими каплями изотонического раствора хлорида натрия, который вкалывается параллельно продольной оси лимфатического узла. Игла проталкивается в разных направлениях до противоположной стенки капсулы узла и содержимое шприца медленно вводится. Пальцами левой кисти лимфатический узел слегка массируется. При медленном извлечении иглы одновременно выдвигают поршень шприца, аспирируя содержимое лимфатического узла. Материал наносится на предметное стекло (при малом количестве материала добавляется капля изотонического раствора хлорида натрия), покрывается покровным стеклом. Исследование нативного препарата проводится в темном поле зрения при помощи светооптического микроскопа с темнопольным конденсором (объектив 40, 7х, 10х или 15х). Бледные трепонемы могут обнаруживаться также в окрашенных препаратах. При окраске по Романовскому-Гимзе бледные трепонемы окрашиваются в розовый цвет, по Фонтану и Морозову в коричневый (черный), по методу Бурри неокрашенные трепонемы выявляются на темном фоне.Серологическая диагностика
Важное значение в диагностике сифилиса, оценке эффективности лечения, установлении критерия излеченности, выявления скрытых, резистентных форм придается стандартным (классическим) и специфическим серологическим реакциям. К стандартным или классическим серологическим реакциям (КСР) относятся:- Реакция Вассермана (РВ),
- осадочные реакции Кана и Закса-Витебского (цитохолевая),
- реакция на стекле (экспресс-метод),
- реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ),
- реакция иммунофлюоресценции (РИФ).
Реакция Вассермана (РВ)
- разработана А.Вассерманом (A.Wasserman) совместно с А.Нейссером (A.Neisser) и Ц.Бруком (C.Bruck) в 1906 году. Реакции Вассермана основана на феномене связывания комплемента (реакция Борде-Жангу) и позволяет определять противолипидные антитела (реагины). Согласно современным представлениям, в реакции Вассермана определяются антитела к липидам макроорганизма, а не бледной трепонемы и реакция выявляет аутоиммунный процесс, который вызывается денатурированием бледными трепонемами тканей макроорганизма с образованием липопротеидного комплекса (конъюгата), в котором липиды (гаптены) являются детерминантой.Обычно РВ ставится с двумя или тремя антигенами. Наиболее часто применяется отличающийся высокой чувствительностью кардиолипиновый антиген (экстракт из сердца быка, обогащенный холестерином и лецитином) и трепонемный антиген (обработанная ультразвуком взвесь анатогенных культуральных бледных трепонем). Совместно с реагинами сыворотки крови больного эти антигены образуют иммунный комплекс, способный адсорбировать и связывать комплемент. Для визуального определения образованного комплекса (реагины + антиген + комплемент) в качестве индикатора применяется гемолитическая система (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой). Если комплемент связан в 1 фазе реакции (реагины + антиген + комплемент), гемолиз не наступает - эритроциты выпадают в легко заметный осадок (РВ положительная). Если в 1 фазе комплемент не связан вследствие отсутствия в испытуемой сыворотке реагинов, он будет использован гемолитической системой и произойдет гемолиз (РВ отрицательная). Степень выраженности гемолиза при постановке РВ оценивается плюсами: полное отсутствие гемолиза ++++ или 4+ (РВ резкоположительная); едва начавшийся гемолиз +++ или 3+ (РВ положительная); значительный гемолиз ++ или 2+ (РВ слабоположительная); непонятная картина гемолиза ± (РВ сомнительная); полный гемолиз - (реакция Вассермана отрицательная).
Помимо качественной оценки РВ имеется количественная постановка с различными разведениями сыворотки (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный (4+) результат. Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых клинических форм сифилитической инфекции, а также при проведении контроля за эффективностью лечения.
В настоящее время реакция Вассермана ставится с двумя антигенами (кардиолипиновый и трепонемный озвученный штамм Рейтера). Как правило, РВ становится положительной на 5-6 неделе после заражения у 25-60% больных, на 7-8 неделе - у 75-96%, на 9-19 неделе - у 100%,
хотя в последние годы иногда раньше или позже. При этом, титр реагинов постепенно нарастает и достигает максимальной величины (1:160-1:320 и выше) в случае появления генерализованных высыпаний (сифилис вторичный свежий). При позитивации РВ выставляется диагноз первичного серопозитивного сифилиса.
При вторичном свежем
и вторичном рецидивном сифилисе РВ положительная у 100% больных, но у истощенных больных с ослабленным иммунитетом может наблюдаться отрицательный результат. Впоследствии титр реагинов постепенно понижается и при вторичном рецидивном сифилисе обычно не превышает 1:80-1:120.
При третичном сифилисе
РВ положительная у 65-70% больных и обычно наблюдается низкий титр реагинов (1:20-1:40). При поздних формах сифилиса (сифилис внутренних органов, нервной системы) положительная РВ наблюдается в 50-80% случаев. Титр реагинов колеблется от 1:5 до 1:320.
При скрытом сифилисе
положительная РВ отмечается у 100% больных. Титр реагинов от 1:80 до 1:640, а при позднем скрытом сифилисе от 1:10 до 1:20. Быстрое снижение титра реагинов (вплоть до полной негативации) во время лечения свидетельствует об эффективности лечения.
Недостатки реакции Вассермана
- недостаточная чувствительность (в начальной стадии первичного сифилиса отрицательная). Она негативная также у 1/3 больных, если они в прошлом лечились антибиотиками, у пациентов третичным активным сифилисом с поражениями кожи и слизистых, костно-суставного аппарата, внутренних органов, центральной нервной системы, при позднем врожденном сифилисе.
Недостаточная специфичность
- реакция Вассермана может быть положительная у лиц, которые ранее не болели и не болеют сифилисом. В частности ложноположительные (неспецифические) результаты РВ отмечаются у больных, которые страдают системной красной волчанкой, лепрой, малярией, злокачественными новообразованиями, поражениями печени, обширными инфарктами миокарда и другими заболеваниями, а иногда у совершенно здоровых людей.
Кратковременная ложноположительная реакция Вассермана выявляется
у некоторых женщин перед родами или после них, у лиц, злоупотребляющих наркотиками, после наркоза, приема алкоголя. Как правило, ложноположительная РВ выражена слабо, чаще с низким титром реагинов (1:5-1:20), положительная (3+) или слабо положительная (2+). При массовых серологических обследованиях частота ложноположительных результатов составляет 0,1-0,15%. Для преодоления недостаточной чувствительности, пользуются постановкой на холоде (реакция Колляра) и одновременно она ставится с другими серологическими реакциями.
Осадочные реакции Кана и Закса-Витебского
Реакция Вассермана применяется в комплексе с двумя осадочными реакциями (Кана и Закса-Витебского ), при постановке которых готовятся более концентрированные антигены. Экспресс метод (микрореакция на стекле) - относится к липидным реакциям и основан на реакции преципитации. Ставится со специфическим кардиолипиновым антигеном, 1 каплю которого смешивают с 2-3 каплями исследуемой сыворотки крови в лунках специальной стеклянной пластины.Преимущество - быстрота получения ответа (через 30-40 мин). Результаты оцениваются по количеству выпавшего осадка и величины хлопьев. Выраженность определяют как КСР - 4+, 3+, 2+ и отрицательная. Следует отметить, что ложноположительные результаты наблюдаются чаще, чем при РВ. Как правило, экспресс-метод применяется при массовых обследованиях на сифилис, при обследовании в клинико-диагностических лабораториях, соматических отделениях и больницах. На основании результатов экспресс-метода диагноз сифилиса выставлять запрещается, исключается его применение у беременных, доноров, а также для контроля после лечения.
Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)
Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) - предложена в 1949 году Р.Нельсоном (R.W.Nelson) и М.Мейером (M.Mayer). Является наиболее специфичным диагностическим тестом на сифилис. Однако сложность и дороговизна постановки ограничивает ее применение. В сыворотке крови больных производится определение видеоспецифичных антител (иммобилизинов), которые приводят к неподвижности бледных трепонем в присутствии комплемента. Антигеном являются живые патогенные бледные трепонемы, выделяемые от зараженных сифилисом кроликов. С помощью микроскопа проводится посчет утративших подвижность (иммобилизованных) бледных трепонем и оцениваются результаты РИБТ: иммобилизация бледных трепонем от 51 до 100% - положительная; от 31 до 50% - слабо положительная; от 21 до 30% - сомнительная; от 0 до 20% - отрицательная.РИБТ имеет значение при дифференциальной диагностике для отграничения ложноположительных серологических реакций от реакций, обусловленных сифилисом. Поздно становится положительной чем РВ, РИФ и поэтому для диагностики заразных форм сифилиса ее не применяют , хотя во вторичном периоде сифилиса она положительная у 85-100% больных.
В третичном периоде сифилиса с поражением внутренних органов, опорно-двигательного аппарата, нервной системы РИБТ положительная в 98-100% случаев (РВ часто отрицательная ).
Необходимо помнить, что РИБТ может оказаться ложноположительной в случае наличия в исследуемой сыворотке трепонемоцидных препаратов (пенициллин, тетрациклин, макролиты и др.), которые вызывают неспецифическую иммобилизацию бледных трепонем. С этой целью кровь на РИБТ исследуется не ранее 2 недель после окончания приема антибиотиков и других лекарственных средств.
РИБТ как и РИФ в процессе лечения медленно негативируются, поэтому она не применяется в качестве контроля в процессе лечения.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - разработана в 1954 году A.Coons и впервые применена для диагностики сифилитической инфекции Deacon, Falcone, Harris в 1957 году. РИФ основана на непрямом методе определения флюоресцирующих антител. Антигеном для постановки являются фиксированные на предметных стеклах тканевые патогенные бледные трепонемы, на которые наносят исследуемую сыворотку. Если в исследуемой сыворотке имеются противотрепонемные антитела, относящиеся к IgM и IgG, они прочно связываются с антигеном - трепонемами, что выявляется в люминесцентном микроскопе с помощью антивидовой ("противочеловеческой") флюоресцирующей сыворотки.Результаты РИФ учитываются по интенсивности свечения бледных трепонем в препарате (желто-зеленое свечение). При отсутствии противотрепонемных антител в сыворотке, бледные трепонемы не определяются. При наличии антител выявляется свечение бледных трепонем, степень которого выражается в плюсах: 0 и 1+ - отрицательная реакция; от 2+ до 4+ - положительная.
РИФ относится к групповым трепонемным реакциям и ставится в разведении исследуемой сыворотки в 10 и 200 раз (РИФ-10 и РИФ-200). РИФ-10 считается более чувствительной, однако часто выпадают неспецифические положительные результаты, чем при постановке РИФ-200 (отличается более высокой специфичностью). Как правило, РИФ становится положительной раньше, чем РВ - положительная при первичном серонегативном сифилисе у 80% больных, у 100% во вторичном периоде сифилиса, всегда положительная при скрытом сифилисе и в 95-100% случаев при поздних формах и врожденном сифилисе.
Специфичность РИФ повышается после предварительной обработки исследуемой сыворотки сорбентом-ультраозвученным трепонемным антигеном, который связывает групповые антитела (РИФ - абс).
Показания к постановке РИБТ и РИФ - диагностика скрытого сифилиса для подтверждения специфичности комплекса липидных реакций в случае предположения сифилитической инфекции на основании положительной РВ. Положительные РИБТ и РИФ являются доказательством латентного сифилиса. При ложноположительной РВ при различных болезнях (системная красная волчанка, злокачественные новообразования и др.) и если повторные результаты РИБТ и РИФ отрицательные, это свидетельствует о неспецифическом характере РВ. Подозрение на поздние сифилитические поражения внутренних органов, опорно-двигательного аппарата, нервной системы при наличии у больных отрицательной РВ. Подозрение на первичный серонегативный сифилис, когда у пациентов при многократных исследованиях отделяемого с поверхности эрозии (язвы), при пунктате из увеличенных регионарных лимфатических узлов бледная трепонема не обнаруживается - в этом случае ставится только РИФ - 10.
При обследовании лиц с отрицательной РВ , которые имели длительные половые и бытовые контакты с больными сифилисом, учитывая вероятную возможность лечения их в недавнем прошлом противосифилитическими препаратами, вызвавшими негативацию РВ. Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA - enzymelinked immunosorbent assay) - метод разработан E.Engvall и соавт., S.Avrames (1971). Сущность состоит в соединении сифилитического антигена, сорбированного на поверхности твердофазного носителя с антителом исследуемой сыворотки крови и выявлении специфического комплекса антиген-антитело при помощи меченной ферментом антивидовой иммунной сыворотки крови. Это позволяет оценивать результаты ИФА визуально по степени изменения окраски субстрата под действием фермента, входящего в состав конъюгата. Недостоверные результаты ИФА могут возникать в результате недостаточного разведения инградиентов, нарушения температурного и временного режимов, несоответствии рН растворов, загрязнении лабораторной посуды, неправильной технике промывки носителя.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)
Предложена в качестве диагностического теста на сифилис T.Rathlev (1965,1967), T.Tomizawa (1966). Макромодификация реакции называется ТРНА, микромодификация - МНА-ТР, автоматизированный вариант - AMNA-TR, реакция с макрокапсулами из полимочевины вместо эритроцитов - МСА-ТР. Чувствительность и специфичность РПГА аналогичны РИБТ, РИФ, но РПГА имеет меньшую чувствительность при ранних формах сифилиса по сравнению с РИФ-абс и большую при поздних, при врожденном сифилисе. РПГА ставится в качественном и количественном вариантах.Техника взятия крови для серологических реакций
Для исследования на РВ, РИФ, РИБТ кровь берут из локтевой вены натощак или не раньше 4 час после приема пищи стерильным шприцом или одной иглой (самотеком). В месте взятия кожу предварительно обрабатывают 70% спиртом. Шприц и игла должны быть промыты изотоническим раствором хлорида натрия. В чистую сухую холодную пробирку вливают 5-7 мл исследуемой крови. На пробирку клеится чистая бумага с фамилией, инициалами пациента, номером истории болезни или амбулаторной карты, датой взятия крови. После взятия крови пробирка помещается в холодильник с температурным режимом +4°+8°С до следующего дня. На следующий день сыворотка сливается для исследования. В случае не использования крови на следующий день, сыворотку необходимо слить со сгустка и хранить в холодильнике не более 1 недели. Для исследования на РИБТ пробирка должна быть специально подготовлена и стерильна. В случае нарушения правил забора крови на исследование, несоблюдение условий может произойти искажение результатов.Не рекомендуется производить забор крови для исследования после приема пищи, алкоголя, различных медикаментозных препаратов, после введения различных вакцин, во время менструального цикла у женщин.
Для исследования на экспресс-метод кровь берегся из кончика пальца, как это делается при ее взятии на СОЭ, но берут кровь на 1 капилляр больше. Экспресс-метод можно также ставить с сывороткой крови, полученной при помощи венопункции. Если возникает необходимость исследования крови в отдаленных лабораториях, вместо крови можно пересылать сухую сыворотку (метод сухой капли). Для этого на следующий день после взятия крови, сыворотку отделяют от сгустка и набирают в стерильный шприц в количестве 1 мл. Затем сыворотку выливают в виде 2 отдельных кружков на полоску плотной писчей бумаги (вощаная бумага или целлофан) размером 6x8 см. На свободном крае бумаги пишется фамилия, инициалы обследуемого и дата забора крови. Бумагу с сывороткой защищают от прямых солнечных лучей и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Сыворотка засыхает в виде небольших кружочков блестящей желтоватой стекловидной пленки. После этого, полоски бумаги с высушенной сывороткой свертывают как аптечный порошок и отсылают в лабораторию, указывая диагноз и с какой целью исследуется.
Серологическая резистентность
У части (2% и более) больных сифилисом, несмотря на проведенную полноценную противосифилитическую терапию, наблюдается замедление (отсутствие) негативации серологических реакций после окончания лечения до 12 мес и более. Возникает так называемая серологическая резистентность, которая в последние годы стала часто наблюдаться. Различают формы серологической резистентности:- Истинная (абсолютная, безусловная) - необходимо провести дополнительное противосифилитическое лечение, комбинируя с неспецифической терапией для повышения иммунных сил организма.
- Относительная - после полноценного лечения бледные трепонемы образуют цист- или L-формы, которые находятся в организме в маловирулентном состоянии и вследствие этого дополнительное лечение не изменяет показатели серологических реакций, особенно РИФ и РИБТ.
Псевдорезистентность
- после проведенного лечения несмотря на положительные серологические реакции бледная трепонема в организме отсутствует. Антигена в организме нет, но продолжается выработка антител, которые фиксируются при постановке серологических реакций.
Серологическая резистентность может развиваться вследствие:
- неполноценного лечения без учета давности и стадии заболевания;
- недостаточной дозы и в частности из-за неучета массы тела пациентов;
- нарушения интервала между введением препаратов;
- сохранения в организме бледных трепонем несмотря на проведенное полноценное специфическое лечение, из-за их стойкости к пенициллину и другим химиопрепаратам в случае наличия скрытых, осумкованных очагов поражения во внутренних органах, нервной системе, лимфатических узлах, которые малодоступны для антибактериальных препаратов (нередко бледные трепонемы обнаруживаются в тканях рубца через много лет после окончания терапии, в лимфатических узлах иногда удается обнаружить бледные трепонемы через 3-5 лет после противосифилитической терапии);
- снижения защитных сил при различных заболеваниях и интоксикациях (эндокринопатии, алкоголизм, наркомания и др.);
- общего истощения (приемом пищи бедной витаминами, белками, жирами).
- сопутствующими неспецифическими заболеваниями внутренних органов, нарушениями сердечнососудистой системы, ревматизмом, дисфункциями эндокринной и нервной систем, тяжелыми хроническими дерматозами, злокачественными новообразованиями;
- поражениями нервной системы (тяжелые травмы, сотрясение головного мозга, психические травмы);
- беременностью; хроническими интоксикациями алкоголем, никотином наркотиками; инфекционными болезнями (малярия, туберкулез, вирусный гепатит, дизентерия, сыпной, брюшной и возвратный тифы).
Диагностика сифилиса по сей день считается достаточно сложной процедурой, не всегда гарантирующей быстрые и правильные результаты. Как провериться на сифилис и верно определить результаты всех проведенных исследований?
Что такое лабораторное подтверждение указанного диагноза, каким образом оно производится? Как диагностировать вторичный сифилис или латентную стадию заболевания? Рассмотрим эти вопросы в данной статье.
Методы диагностики
Сбор анамнеза
Прежде всего, при наличии подозрений на сифилис следует немедленно отправиться на консультацию к венерологу. Уже на стадии консультирования и осмотра врач может выставить предварительный анализ.
Для диагностики венерологу нужно собрать анамнез, т.е. всю необходимую информацию: об особенностях половой жизни пациента, наличии у него контактов с возможными сифилитиками, жалобах, были ли раньше венерические заболевания и пр.
Получив эту информацию, венеролог концентрируется на решении вопроса, какому заболеванию свойственна выявленная в ходе сбора анамнеза симптоматика. Далее с целью проверки на недуг проводится клинический осмотр пациента.
Осмотр больного
Наибольшее внимание врач уделяет осмотру и изучению кожи и слизистых оболочек половых органов, заднего прохода, а также слизистых полости рта. Тщательно ощупываются лимфатические узлы, выявляются очаги их некроза.
На этом этапе обследования можно с высокой точности распознать недуг, т.е. выставить первичный диагноз. Но чтобы удостовериться в этом на 100%, необходим целый ряд лабораторных исследований с положительными данными.
Этот вид диагностики делится на два отдельных исследования. В первом случае можно выявить возбудителя этого сложного заболевания, во втором – определить степень изменения иммунитета больного.
Микроскопия
Выявление бледной трепонемы осуществляется с помощью известной медицинской технологии под названием темнопольная микроскопия бактерий. Науке известно, что бледная трепонема плохо окрашивается традиционными красителями.
Поэтому на темном поле специального микроскопа она немедленно становится видна в виде небольшой спирали. При этом исследуется материал, взятый из язвочки, похожей на сифилитическую, являющейся результатом первичной инфекции.
Реакция флюоресценции
В этом случае биологический материал обрабатывается специальной сывороткой, в результате действия которой бледная трепонема начинает светиться, выглядит очень красиво и нарядно.
Полимеразная реакция
С помощью этой реакции врач обнаружит ДНК бледной трепонемы, т.е. посредством ПЦР можно окончательно доказать наличие в организме больного данного инфекционного агента.
Как диагностировать это заболевание по иммунологическим показателям? Их исследование в медицине именуется серологией. Серодиагностика обладает множеством современных методов, они широко применяются на практике.
Все эти методы основаны на исследовании крови пациента. Одна группа методов направлена на выделение в крови антител против бледной трепонемы, Вторая группа изучает изменения в иммунитете в связи с деятельностью этой вредоносной бактерии.
1) Микроскопическая реакция преципитации.
В ходе этого исследования в крови больного выявляются и проверяются антитела, которые были выработаны его иммунной системой против клеток организма, поврежденных в результате деятельности бледной трепонемы.
Этот вид тестирования имеет высокую достоверность, но может выявить не только сифилис, но и иные заболевания (например, гонорею, её возбудителями являются гонококки). Поэтому с помощью теста появляется только подозрение на инфекцию.
Преципитацию часто используют не для диагностики, но и изучения эффективности терапии. Если пациент благополучно излечился, то указанная выше реакция становится отрицательной.
Этим этот вид лабораторного исследования существенно отличается от других вариантов серологических исследований, которые после излечения долго могут давать положительную реакцию, фиксировать наличие болезни в организме человека.
2) Реакция Вассермана.
В результате такого тестирования ставятся «плюсы». Чем больше «плюсов», тем достоверней наличие бледной трепонемы в организме человека. Максимальный положительный результат – четыре «плюса» или «++++».
Что такое трепонемная серология?
1) Реакция иммунологической флюоресценции.
В ходе данного тестирования обнаруживаются антитела, которые вырабатывает иммунитет человека, зараженного трепонемой. В ходе исследования сыворотка крови человека взаимодействует с препаратом, имеющим в своем составе антитела.
После смешивания обоих компонентов: сыворотки и антител, помеченных специальным светящимся веществом, они связываются друг с другом, после чего исследуются посредством специального микроскопа.
2) Иммуноферментный анализ.
С помощью этого анализа эффективно выявляется большинство инфекционных болезней. В ходе него происходит реакция антигена с антителами самого различного класса. При этом легко определить их количество.
По типу антител и их количеству можно сделать выводы по поводу диагноза, длительности течения выявленного заболевания, развитию патологического процесса, активности трепонемы, силе иммунной системы больного.
Благодаря обилию показателей зарождения, развития и течения болезни, этот анализ просто не заменим при диагностике множества инфекционных болезней. А также в качестве контроля их развития и излечения.
3) Реакция гемагглютинации.
В результате этого теста склеиваются эритроциты. Суть ее в том, что после предварительной подготовки на поверхности эритроцитов, фиксируются белки трепонемы.
Эти материалы перемешиваются с сывороткой крови, в которой имеются антитела к этой вредоносной бактерии. После склеивания эритроцитов исследуемая кровь становится густой и зернистой.
Интересно, что даже после полного излечения от недуга описанная выше реакция может давать положительный результат и сбивать врачей, занимающихся диагностикой иных инфекционных болезней.
Изменения в иммунной системе сифилитика
Итак, диагностика недуга и контроль его эффективного излечения – сложная профессиональная задача. А больному без серьезного образования в области медицины разобраться в хитросплетениях анализов и реакций попросту невозможно.
Попробуем просто и доступно объяснить развитие изменений в иммунной системе больного, и по каким лабораторным показателям это можно быстро выявить, чтобы своевременно поставить правильный диагноз.
Сразу после попадания инфекции (бледной трепонемы) в организм человека она сталкивается с иммунными клетками. Они немедленно идентифицируют ее, как чужеродный и опасный микроорганизм, и начинают действовать.
В крови больного, спустя неделю или месяц, появляются антитела, оказывающие специфическое воздействие на бактерии бледной трепонемы. Их можно разделить на два класса антител.
Первые свидетельствуют, что инфицирование произошло совсем недавно (неделю назад). Вторые говорят о том, что организм уже среагировал должным образом и сформировал собственную защиту, устойчивый иммунитет от болезни.
Перед появлением клинических симптомов этой болезни в крови больного выявляются специфические антитела. В ходе лечения количество антител существенно снижается и постепенно нормализуется. Формируется стойкий иммунитет к трепонеме в будущем.
Как интерпретировать результаты серологии?
Сегодня большинство венерологов в своей профессиональной практике, чтобы диагностировать сифилис чаще всего используются три реакции:
1) преципитации;
2) флюоресценции;
3) гемагглютинации.
Если все три исследования дали отрицательный результат, значит, инфицирование отсутствует, либо диагностика проведена ранее определенного срока. Делать это нужно через семь дней после заражения.
Если все три исследования дали положительный результат, значит, наличие недуга в организме пациента подтверждено, и следует немедленно начать его интенсивное лечение, чтобы болезнь не переросла в хроническую форму.
Если отрицательные показатели выдала только реакция преципитации, значит, у пациента поздняя стадия лечения болезни, или терапия уже завершена. Положительный результат свидетельствует о наличии антител в крови.
Если отрицательные данные только у реакции флюоресценции, следует пройти все исследования вновь, т.к. велика вероятность, что они проведены неправильно и дают ложные показатели.
Если положительные показатели дала только гемагглютинация, значит, она либо ложная (проведена с нарушением установленных правил), либо проведена после окончания терапии заболевания.
Если положительные показатели дала только реакция флюоресценции, это либо ранняя стадия недуга, либо проведена после эффективной терапии. Если положительную реакцию дала только преципитация, то результат исследований – ложен.
Следовательно, для качественной диагностики этого сложного инфекционного заболевания только серологии недостаточно. Для постановки правильного и окончательного диагноза обязателен весь комплекс клинических исследований и дифференциальная диагностика.
Содержание статьи
Лабораторная диагностика сифилиса
В последнее десятилетие в лабораторной диагностике сифилиса произошли значительные изменения. Такие классические тесты, как реакция связывания комплемента (реакция Вассермана), реакция Кана, цитохолевая и другие реакции преципитации утратили свою актуальность вследствие недостаточной чувствительности и большого количества неспецифических результатов. Вместо них используются во много раз более чувствительные и специфичные тесты. Внедрены молекулярно-биологические ДНК- и РНК-тесты. При интерпретации результатов тестирования используется компьютерный анализ, что исключает их субъективную оценку. Тестирование автоматизировано, методы стандартизированы, разработаны и сертифицированы различные диагностические комплексы. Это открывает широкие возможности для диагностики сложнейших случаев заболевания. В диагностике сифилиса используются:1. Бактериоскопия.
2. Методы серологического исследования (неспецифические и специфические).
3. Исследование спинномозговой жидкости (СМЖ).
4. Гистологическое исследование - преимущественно в стадии третичного сифилиса.
5. Бактериоскопическое исследование.
6. Микроскопическое исследование нативного препарата отделяемого эрозивных или язвенных высыпаний или пунктата из лимфоузла для выявления Treponema pallidum.
Бактериоскопический метод
Получение материала и подготовка к исследованиюМатериал со слизистых оболочек, кожи половых органов или экстрагенитальной области с подозрительными эрозивными или язвенными дефектами, непосредственно с поверхности твердого шанкра, широкой кондиломы, эрозивных папул получает врач лаборатории или любой другой врач в помещении, где подготовлен микроскоп с темным полем зрения. Поверхность ulcus durum или эрозивных папул протирается тампоном, смоченным в физиологическом растворе, и затем раздражается бактериологической платиновой или вольфрамовой петлей несколько минут, пока из глубоких слоев не покажется прозрачная тканевая жидкость. Необходимо следить, чтобы к ней не примешивалась кровь, в противном случае это затруднит исследование. Полученная жидкость переносится петлей на предметное стекло, куда при необходимости можно добавить физиологический раствор. Подготовленный препарат исследуется в темном поле микроскопа. Если результат негативный, исследование повторяется несколько дней подряд, а в промежутках между исследованиями применяются аппликации с физиологическим раствором.
Перед микроскопическим исследованием нельзя использовать антибиотики и местные антисептические средства!
Исследование
Полученный материал с каплей физиологического раствора, помещенный на предметное стекло и накрытый покровным стеклом, исследуется под микроскопом с помощью объектива с 40-кратным увеличением и окуляра с 10-кратным увеличением. Для микроскопического подтверждения диагноза необходимо обнаружить, по крайней мере, 2-3 морфологически типичные, живые трепонемы с характерными движениями. Отрицательный результат не исключает вероятность заболевания сифилисом, поэтому исследование необходимо повторить несколько раз. Употребление пациентом антибиотиков или местных антисептических средств является важным моментом в анамнезе.
Клиническое значение
Диагноз первичного серонегативного сифилиса может быть подтвержден только при наличии бледных трепонем. У пациентов с приобретенным или с врожденным сифилисом трепонемы обнаруживаются во всех сифилидах как раннего, так и позднего сифилиса. Интенсивность тканевой реакции обратно пропорциональна количеству этих микроорганизмов, наибольшее количество которых находится в первичной сифиломе (твердый шанкр), в региональных лимфоузлах и папулах вторичного свежего сифилиса, а наименьшее - в поздних сифилидах. У пациентов с вторичным сифилисом бледные трепонемы могут обнаруживаться во всех органах.
В циркулирующей крови трепонемы могут присутствовать кратковременно только у пациентов с вторичным свежим сифилисом и ранним врожденным сифилисом. Кровь является неблагоприятной средой для трепонем, которую они быстро покидают, мигрируя в ткани. Чрезвычайно трудно обнаружить трепонемы в цереброспинальной жидкости даже у пациентов с tabes dorsalis и прогрессивным параличом. Сперма человека является инфекционной. Моча, пот, слюна не являются контагиозными, если они не соприкасаются с мокнущими высыпаниями. Напротив, в молоке матери трепонемы обнаруживаются. У больных сифилисом трепонемы можно выявить в пунктате лимфоузлов, в селезенке и в неспецифических повреждениях (в экссудате полостных элементов различного происхождения, например, в пузырьках herpes simplex). Метод характеризуется низкой себестоимостью, ответ можно получить в течение получаса.
Возможные ошибки
Для быстрой диагностики сифилиса важно, чтобы больной не занимался самолечением. Если поверхность шанкра, кондиломы или эрозивной папулы покрыта корочкой, образовавшейся в результате вторичного инфицирования, ее следует очистить с помощью физраствора.
Раздражение поверхности элемента с целью получения тканевой жидкости необходимо выполнять очень осторожно, чтобы не вызвать кровотечение, поскольку наличие эритроцитов в микропрепарате затрудняет качественную диагностику. Исследование считается положительным только при обнаружении морфологически типичных трепонем с наличием, по крайней мере, 8 завитков и характерными движениями. Treponema pallidum необходимо дифференцировать с Т. refringens, Т. balantidis, Т. phagadenis, Т. gracilis, Т. macrodentinum, T.microdentinim.
Серодиагностика сифилиса
В выявлении и подтверждении диагноза сифилиса, особенно в случае поздних и латентных форм заболевания, когда клинические проявления ничтожны или отсутствуют, решающее значение отдается серологическим методам диагностики. Отмечены случаи, когда о заболевании сифилисом свидетельствуют только полученные специфические положительные результаты тестирования при исследовании сыворотки или плазмы.Неспецифические (нетрепонемные) тесты
К неспецифическим (нетрепонемным) тестам, являющимся методами экспресс-диагностики сифилиса, относятся RPR (Rapid Plasma Reagins), тест с инактивированной сывороткой - МРП (микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном) и их модификации. Это так называемые флокуляционные тесты, где сформировавшийся в ходе реакции комплекс «антиген + антитело» образует хлопья, которые различимы при помощи лупы. Во всех указанных тестах в качестве антигена используется кардиолипиновый антиген, полученный из сердечной мышцы быка и не имеющий никакой связи с антигенами возбудителя сифилиса Treponema pallidum.В диагностике сифилиса нетрепонемные тесты используются в качестве скрининговых (отборочных) и не подходят для подтверждения диагноза сифилиса. Такие тесты применяются для обследования больших групп населения во время профилактических осмотров или в эпидемиологически неблагоприятной ситуации. Тесты достаточно чувствительны, технически просты, однако требуют специально обученного персонала. Результаты тестирования должен оценивать и подтверждать врач. Для экспресс-диагностики используются преимущественно серологические тесты МРП и RPR. Чувствительность нетрепонемных тестов при ранних формах сифилиса составляет приблизительно 70%, в случае вторичного сифилиса - 100%, при латентных формах - 30%. Неспецифические тесты могут давать ложноположительные результаты в 2-2,8% случаев. У отдельных категорий пациентов, например, у беременных, это число может увеличиваться до 3-3,5%. МРП и RPR становятся позитивными через 1 -4 недели после появления шанкра, то есть через 1-1,5 месяца после инфицирования. Примерно в 2% случаев наблюдается так называемый феномен «прозоны», когда на фоне выраженной клинической картины сифилиса и положительных результатов специфических серологических реакций RPR могут не давать положительных результатов. В таких случаях положительный результат получают, разбавив образец сыворотки. При обследовании беременных, доноров, пациентов отоларингологического, неврологического и психоневрологического отделений, нетрепонемные тесты обязательно применяются в комплексе со специфическим диагностическим тестом (РПГА, ИФА).
Количественные методы (определение титра антител) МРП и RPR используются для контроля эффективности лечения.
Принцип МРП
При соединении эмульсии кардиолипинового антигена с плазмой или сывороткой больного сифилисом образуется флокулят (комплекс «антиген + антитело»), который выглядит как белые снежинки. У каждой из тест-систем (МРП, RPR) имеются свои технические особенности, однако принцип метода одинаков.
Исследуемый материал Плазма или сыворотка, используемые для анализа, должны быть прозрачными. Для тестирования не подходит хилезный или гемолизированный материал.
- Получение плазмы из капиллярной крови: кровь из пальца берут аналогично методике
определения СОЭ. В пипетку Панченко набирается 5% раствор цитрата натрия до отметки «К», а затем выливается обратно в бутылочку до отметки на пипетке «25». Оставшийся цитрат натрия сливается в пробирку для центрифуги, куда добавляют три пипетки крови из пальца пациента, набранной до отметки «К», и перемешивают. Кровь оставляют при комнатной температуре до разделения плазмы и эритроцитов. Чтобы ускорить процесс, кровь можно центрифугировать. Полученную плазму забирают пипеткой Пастера или специальной пипеткой и используют для диагностики. Для получения плазмы рекомендуется применять специальные микроветы. Материал необходимо доставить в лабораторию в течение 4-6 часов.
- Получение инактивированной сыворотки: сыворотку собирают либо при ее отделении от сгустка при отстаивании крови, либо путем центрифугирования стерильно взятой крови из вены. В холодильнике сыворотку можно хранить при температуре 4°С до 5 дней. В лаборатории полученная сыворотка инактивируется при температуре +5б°С в течение 30 мин. Тестирование выполняется на прозрачных полистироловых пластинах с углублением (МРП) или на специальных картонных пластинах (RPR).
Оценка результатов
Результаты МРП читают в проходящем свете на черной основе или над световым источником невооруженным глазом или с помощью лупы. В углублениях, где находится плазма или сыворотка больного сифилисом в различных количествах образуются белые хлопья разного размера. Если в углублении отмечаются большие хлопья или их конгломераты, и окружающая жидкость становится прозрачной, результат считается положительным (4+, 3+). Мелкие хлопья - результат слабо положительный (2+, 1+). В отрицательном случае хлопья не образуются (негативный). В сомнительных случаях (+-) следует ориентироваться по «отрицательному контролю». Если в углублении отрицательного контроля хлопья не образуются, результат оценивается как сомнительный (+-). Исследование продолжается количественным методом, путем разбавления сыворотки, поскольку необходимо исключить так называемый феномен «прозоны>, когда в неразведенном образце плазмы или сыворотке преципитат не образуется, а при его разведении возникают хлопья.
Для проведения RPR-теста используются готовые к употреблению сертифицированные реагиновые комплексы.
Количественный метод МРП, RPR используется для определения количества антител в образце исследуемой сыворотки во время и после лечения.
Возможные ошибки
Неправильное взятие крови из пальца - в капилляре находятся пузырьки, неточно фиксируется отметка на капилляре.
1. В реакции отсутствует контрольная сыворотка (также слабо положительной).
2. В готовой эмульсии неравномерная концентрация антигена по причине недостаточного перемешивания перед применением.
3. Бактериальное инфицирование рабочего раствора.
4. Несоблюдение правил хранения и изготовления плазмы, сыворотки, антигенов и их рабочего раствора.
5. Использование двухвалентного цитрата натрия вместо трехвалентного.
6. Нарушение правил использования посуды, пипеток, несоблюдение порядка исследования.
Несоблюдение упомянутых правил может давать как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты.
Специфические (трепонемные) тесты
С помощью специфических тестов в сыворотке больного сифилисом обнаруживаются антитела, образованные в организме к специфическим антигенам Treponema pallidum. Трепонемные тесты используются для постановки и подтверждения диагноза, а также в дифференциальной диагностике. Для специфических тестов характерны большая чувствительность и высокоспецифичные результаты. Механизмы специфических тестов не одинаковы, с их помощью можно обнаружить различные антитела, поэтому показания к их использованию различаются. Назначая эти исследования, врач должен понимать сущность каждого теста, уметь обосновать свой выбор, ориентироваться в разнообразных тестах, чтобы выбрать оптимальный вариант для постановки диагноза и соответствующего лечения, а также сделать заключение о его результатах.К трепонемным тестам, наиболее часто используемым в диагностике относятся РПГА и И ФА.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА, ТРНА)
Принцип методаSyphilis TPHA-Test (Treponema pallidum haemagglutination test) - реакция непрямой гемагглютинации, которую используют для выявления специфических антител к Treponema pallidum. Эритроциты барана или петуха сенсибилизируются антигеном Treponema pallidum. В присутствии антител происходит агглютинация сенсибилизированных клеток - в микролунках образуются специфические рисунки. Клеточная суспензия содержит также трепонемный экстракт Рейтера, который абсорбирует непатогенные трепонемные антитела.
Исследуемый материал
Исследуется только сыворотка. Не подходят гемолизированные и мутные образцы. Образцы можно хранить 24 часа от +2 до + 8°С, или до 4 недель при температуре - 20°С.
Характеристика метода РПГА - хороший диагностический тест, однако положительные результаты необходимо подтверждать с помощью какого-либо другого специфического теста диагностики сифилиса. В случае излеченного сифилиса результаты РПГА могут длительно оставаться положительными. Ложноположительные результаты наблюдаются в случае лепры, инфекционного мононуклеоза, а также в случае заболеваний соединительной ткани. Результаты читают через 45-60 минут.
Интерпретация результатов
Результаты оцениваются по системе «4+». - Отрицательный результат определяется тогда, когда в центре лунки с сывороткой для теста образуется ясная и четкая точка из неагглютинированных клеток с/или без очень маленького просвета в центре. Сомнительный результат определяется тогда, когда в центре точки из неагглютинированных клеток вместо маленького просвета появляется кольцо небольшой плотности на прозрачном фоне. Такие образцы необходимо тщательно проверить повторно (+/-, «1+» - сомнительный). Положительный результат определяется в том случае, когда клетки агглютинируют, образуя подобный поляне участок, вокруг которого формируется кольцо. В зависимости от его величины результат реакции оценивается соответственно «2+», «3+» или «4+».
Если в контрольной лунке теста наблюдается точка неагглютинирующих клеток, это значит, что сыворотка пригодна к тестированию.
Если в контрольной лунке теста произошла реакция, это значит, что в исследуемом образце содержатся неспецифические агглютинины. Сыворотка для тестирования непригодна и ее необходимо тщательно обработать.
Количественный метод РПГА
Для контроля эффективности лечения можно использовать количественный метод РПГА - определение титра антител. Титрование рекомендуется выполнять при резко положительных пробах, которые оценены как «4+», так как результат «4+» бывает в том случае, если титр пробы > 1:80.Интерпретация результатов
Если в контрольной лунке гемагглютинация не происходит, то наблюдаемая гемагглютинация в лунках теста свидетельствует, что проба положительная. Титр определяется по последнему разведению, которое указывает на результат <4+»:
1. разведение в лунке 1:80
2. разведение в лунке 1:160
3. разведение в лунке 1:320 и т. д. Титровать результаты «3+» или «2+» нет необходимости.
Для исследования каждой пробы необходимо использовать также положительные и отрицательные контрольные сыворотки РПГА. Отрицательная контрольная сыворотка всегда демонстрирует выраженную точку, положительная контрольная сыворотка - гемагглютинацию «4+».
Для РПГА характерна высокая чувствительность, с ее помощью можно обнаружить очень небольшое количество антител в сыворотке. Тест после лечения негативируется очень медленно, он может показывать слабоположительные результаты многие годы после выздоровления.
Тесты иммуноферментного анализа - ИФА
Тест принадлежит к иммуноферментным тестам, которые в последнее время широко используются в мире для диагностики различных инфекционных заболеваний. В диагностику сифилиса ИФА начали внедрять в 80-е годы, когда были разработаны и сертифицированы диагностические тесты и стандартизирована методика тестирования.В основе теста лежит непрямой метод Кунса. В сыворотке больного обнаруживаются специфические антитела. По чувствительности и специфичности тест сравним с иммунофлуоресцентными тестами. С помощью ИФА-теста можно выявить антитела всех существенных классов (IgM, IgA, IgG). Особенно ценен ИФА-тест в ранней диагностике сифилиса, поскольку он становится положительным уже в конце инкубационного периода. ИФА-тест является идеальным методом диагностики, подходящим для одновременного исследования большого числа образцов. Его рекомендуется использовать при обследовании беременных, контактных лиц, доноров и представителей групп риска. ИФА используется также как подтверждающий тест для образцов, демонстрирующих положительные результаты при использовании различных неспецифических тестов и РПГА.
Серологическую диагностику сифилиса затрудняют присутствие в крови ревматоидного фактора, других антител и перекрестные реакции с другими родственными бактериями, например, Treponema phagedenis и Borrelia burgdorferi. При использовании ИФА-теста эти факторы практически не влияют на результаты. Высокая концентрация липидов, гемолиз пробы не являются препятствиями для тестирования, как в случае большинства других тестов.
ИФА-тест позволяет определять все существенные классы антител и показывает высокую степень чувствительности на всех стадиях болезни (чувствительность теста 97-98%, специфичность - 98,5-99%). Отрицательный результат ИФА исключает сифилитическую инфекцию с большой степенью вероятности. В последние годы созданы тест-системы для определения отдельных классов антитрепонемных антител IgM-ИФА, IgG-ИФА. ИФА может оставаться положительным долгие годы даже у пролеченных пациентов, поэтому не используется как критерий выздоровления. У ИФА-тестов не наблюдается феномен «прозоны», который дает ложноотрицательные результаты при других методах тестирования, так как титр специфических антител очень высокий.
Принцип метода
1. АГ осаждают на лунках полистиролового
планшета.
2. Добавляют исследуемую сыворотку, образуется комплекс «АГ+АТ».
3. Добавляют антитела к иммуноглобулинам человека, меченные энзимом.
4. Добавляют субстрат, изменяющий цвет, и по интенсивности окраски определяют активность энзима. Цвет раствора зависит от количества антител в исследуемой пробе.
С помощью этого метода можно определить антитела IgG и IgM вместе, а также антитела класса IgM отдельно. Результаты расцениваются как «положительные» или «отрицательные».
Тесты, подтверждающие диагноз сифилиса
Иммунофлюоресцентные тесты - РИФ (FTA)К этой группе относятся: РИФ-200, РИФ-абс (FTA-abc), IgM РИФ абс (IgM FTA-abc), РИФ ликв.
Начиная с 60-х годов XX столетия для подтверждения и дифференциальной диагностики сифилиса широко используются чувствительные и специфические иммунофлюоресцентные тесты. Антитела-иммунофлюоресцины, определяемые с помощью таких тестов, раньше всего появляются в сыворотке, поэтому тест становится положительным к концу первой недели после инфицирования. Это позволяет диагностировать сифилис, когда другие тесты (кроме ИФА) остаются отрицательными. РИФ-абс при первичном серонегативном сифилисе является положительной в 87% случаях в конце второй и начале третьей недели после появления первичного аффекта. Чтобы уменьшить количество ложноположительных результатов (РИФ-абс - 2,8-3%), рекомендуется использовать комплекс реакций - РИФ-абс + РИФ-200. Ложноположительные результаты при РИФ-200 наблюдаются примерно в 2% случаев. В случае вторичного сифилиса РИФ-абс положительна в 100%, в случае поздней формы заболевания - в 92-100%, в случае специфического поражения внутренних органов - в 94-100%. Даже после лечения сифилиса РИФ-абс очень долго дает положительные результаты, поэтому она не применяется для определения эффективности лечения, если только не используется количественный метод РИФ-абс - определение титра антител.
В последние годы все чаще используется реакция IgM РИФ-абс. В сыворотке больного IgM антитела появляются раньше остальных. Этот тест применяется в ранней диагностике, при обследовании контактных лиц, для контроля эффективности лечения, в дифференциальной диагностике рецидива и реинфекции, а также в случае врожденного сифилиса или для определения присутствия материнских антител у новорожденных.
Как известно, из-за большой молекулярной массы IgM антитела не проникают сквозь плацентарный барьер. В крови матери (больной сифилисом) циркулируют преимущественно IgG антитела, для которых плацентарный барьер не является препятствием, и которые поступают в кровяное русло ребенка. При наличии в сыворотке новоровденного IgM антител, нужно думать о заражении сифилисом. В мире до сих пор нет единого мнения о длительности циркуляции IgM антител в сыворотке больного. Большинство авторов считает, что они достигают своего максимума на 6-9 неделе, и не обнаруживаются после 18-месячного возраста. Немецкий ученый Миллер предполагает, что IgM циркулируют до исчезновения клинических симптомов, О"Нил - что IgM циркулируют в крови до 5 лет. По данным Миллера, в 60% случаев Syphilis lateens praecox IgM в сыворотке больше не обнаруживаются. Если лечение начинается рано, IgM исчезают в течение 5-6 месяцев, если лечение начинается позже - они сохраняются в течение 1-2 лет. Некоторые авторы используют реакцию IgM РИФ-абс как критерий излеченности.
Принцип метода
Исследуемая сыворотка подвергается инкубации вместе с Treponema pallidum (антиген), которая фиксируется на предметном стекле. В случае положительного результата образуется комплекс «антитело + антиген», связанный с обработанными флюоресцеинами антителами к человеческим глобулинам. Перед началом тестирования исследуемую сыворотку обрабатывают сорбентом (непатогенный экстракт Treponema Reiteri), чтобы исключить реакцию связывания неспецифических антител.
В результате получают свечение иммунных комплексов различной интенсивности, которую определяют с помощью люминесцентного микроскопа.
Оценка результатов
Исследование выполняется с помощью люминесцентного микроскопа (ртутно-кварцевая лампа с иммерсионной системой, окуляр с 4-х или 5-кратным увеличением, фильтры в зависимости от марки микроскопа). Результаты
оцениваются по интенсивности свечения иммунных комплексов.
Положительно оцениваются препараты, которые дают свечение 4+, 3+, 2+. Желто-зеленая люминесценция оценивается как 4+, ярко-зеленое свечение - 3+, бледно-зеленое свечение - 2+. При выраженности свечения 1+ реакция считается отрицательной (в препарате наблюдается фоновое окрашивание или окрашивание отсутствует - определяются только тени). Результат «2+» необходимо проконтролировать с помощью других специфических тестов.
Реакция иммобилизации бледных трепонем - РИБТ
Этот тест для диагностики сифилиса разработали в 1949 г. и предложили использовать Р. Нельсон и М. Майер. Даже в наши дни этот тест считается наиболее эффективным в диагностике сифилиса и служит эталоном в наиболее сложных случаях. РИБТ практически не дает ложноположительных результатов. В качестве антигена используется суспензия живых, вирулентных трепонем, полученных из яичек кролика через 7-9 дней после интратестикулярного заражения. Тест технически сложен, требует специально подготовленного персонала и проводится только в специализированных лабораториях. В основе метода лежит феномен, при котором образовавшийся комплекс «антиген + антитело» фиксируется на трепонемах, делая их неподвижными. Необходимо помнить, что антитела-иммобилизины появляются в сыворотке больного относительно поздно, поэтому при первичном и вторичном свежем сифилисе тест слабоположительный или отрицательный. Однако он незаменим при диагностике латентных форм сифилиса, сифилиса внутренних органов, нейросифилиса. После проведения терапии тест негативируется медленно и поэтому не используется для оценки эффективности лечения. Тест может оставаться положительным долгие годы после завершения терапии, в связи с чем используется для ретроспективной диагностики сифилиса.Получение и обработка исследуемой сыворотки
Перед постановкой РИБТ обследуемому пациенту запрещается употреблять антибиотики. После употребления бициллина кровь для исследования на РИБТ берут не ранее, чем через месяц.
Кровь берут из вены натощак в стерильную, сухую, химически чистую пробирку или вакутейнер. Сыворотку необходимо отделить от сгустка в стерильных условиях не позднее чем через 24 часа после взятия крови. Перед исследованием сыворотку следует инактивировать при температуре 5б°С в течение 30 мин. Если одну и ту же сыворотку необходимо исследовать повторно, она инактивируется при температуре 5б°С в течение 15 мин.
Сыворотку можно хранить в холодильнике при температуре 10°С не более 15 дней. Добавление в сыворотку каких-либо консервантов недопустимо!
Вся используемая для проведения реакции посуда (пипетки, пробирки, флаконы и др.) должна быть стерильна.Тестирование проводится в стерильном боксе.
Интерпретация результатов
В темном поле зрения микроскопа определяют число неподвижных трепонем в исследуемом и контрольном препарате, выражая число неподвижных трепонем в процентах.
РИБТ считается отрицательной, если иммобилизация составляет 0-20%; сомнительной - при 21-30%, слабоположительной - при 31-50% и положительной, если иммобилизация превышает 50%. Сыворотки, давшие сомнительный или слабоположительный результат, рекомендуется исследовать повторно. Также желательно повторно провести исследование в тех случаях, когда полученные результаты РИБТ полностью не совпадают с результами других стандартных тестов для диагностики сифилиса. Такие исследуемые сыворотки заслуживают особого внимания, так как результаты РИБТ различны при подтверждении или исключении диагноза сифилиса.
Лечение сифилиса
Длительность лечения и применяемые методына разных стадиях сифилиса различны.
Схемы лечения больных сифилисом в разные периоды:
Превентивное лечение
- Бензатина бензилпенициллин G либо Бициллин-1 по 2,4 млн. ЕД в/м однократно или- Бициллин-3 по 1,8 млн. ЕД либо Бициллин-5 по 1,5 млн. ЕД в/м два раза в неделю № 2 или Бензилпенициллина новокаиновая соль по 600 тыс. ЕД в/м два раза в сутки ежедневно в течение 7 дней или
Прокаин бензилпенициллин по 1,2 млн. ЕД в/м один раз в сутки ежедневно № 7 или Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 1 млн. ЕД в/м каждые 6 часов (4 раза в сутки) ежедневно в течение 7 дней.
Лечение больных первичным сифилисом
- Бензатина бензилпенициллин G по 2,4 млн. ЕД в/м 1 раз в 7 дней № 2 или- Бициллин-1 по 2,4 млн. ЕД в/м один раз в 5 дней № 3 или
- Бициллин-3 по 1,8 млн. ЕД либо Бициллин-5 по 1,5 млн. ЕД в/м два раза в неделю № 5 или
- Прокаин бензилпенициллин по 1,2 млн. ЕД в/м один раз в сутки ежедневно № 10 или
- Бензилпенициллина новокаиновая соль по 600 тыс. ЕД в/м два раза в сутки ежедневно в течение 10 дней или
- Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 1 млн. ЕД в/м каждые 6 часов (4 раза в сутки) ежедневно в течение 10 дней.
Лечение больных вторичным и ранним скрытым сифилисом
- Бензатина бензилпенициллин G по 2,4 млн. ЕД в/м один раз в 7 дней № 3 или Бициллин-1 по 2,4 млн. ЕД в/м 1 раз в 5 дней № 6 илиБициллин-3 по 1,8 млн. ЕД либо Бициллин-5 по 1,5 млн. ЕД в/м два раза в неделю № 10 или Прокаин бензилпенициллин по 1,2 млн. ЕД в/м один раз в сутки ежедневно № 20 или Бензилпенициллина новокаиновая соль по 600 тыс. ЕД в/м два раза в сутки ежедневно в течение 20 дней или
Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 1 млн. ЕД в/м каждые 6 часов (4 раза в сутки) ежедневно в течение 20 дней. У больных с давностью заболевания более 6 месяцев рекомендуется использовать бензилпенициллина новокаиновую соль, прокаин бензилпенициллин либо бензилпенициллина натриевую соль кристаллическую.
Лечение больных третичным, скрытым поздним и скрытым неуточненным сифилисом
Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 1 млн. ЕД в/м каждые 6 часов (4 раза в сутки) ежедневно в течение 28 дней, через две недели - второй курс лечения бензилпенициллина натриевой солью кристаллической в аналогичных дозах либо одним из препаратов средней дюрантности (бензилпенициллина новокаиновая соль, прокаин бензилпенициллин) в течение 14 дней илиПрокаин бензилпенициллин по 1,2 млн. ЕД в/м один раз в сутки ежедневно № 20, через две недели - второй курс прокаин бензилпенициллина в аналогичной дозе № 10 или Бензилпенициллина новокаиновая соль по 600 тыс. ЕД в/м два раза в сутки ежедневно в течение 28 дней, через 2 недели - второй курс бензилпенициллина новокаиновой соли в аналогичной дозе в течение 14 дней.
Лечение больных с поражением внутренних органов и опорно-двигательного аппарата
Лечение больных висцеральным сифилисом рекомендовано проводить в условиях стационара - дерматовенерологического или терапевтического с учетом тяжести поражения. Лечение проводится дерматовенерологом совместно с терапевтом, назначающим сопутствующую и симптоматическую терапию.Лечение больных ранним висцеральным сифилисом
- Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 1 млн. ЕД в/м каждые 6 часов (4 раза в сутки) ежедневно в течение 20 дней или
- Бензилпенициллина новокаиновая соль по 600 тыс. ЕД в/м два раза в сутки ежедневно в течение 20 дней или
Прокаин бензилпенициллин по 1,2 млн. ЕД в/м один раз в сутки ежедневно № 20.
Лечение больных поздним висцеральным сифилисом
Лечение начинается с двухнедельной подготовки антибиотиками широкого спектра действия (тетрациклин, эритромицин, доксициклин). Затем переходят к пенициллинотерапии.
- Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 400 тыс. ЕД в/м каждые 3 часа (8 раз в сутки) ежедневно в течение 28 дней, через 2 недели - второй курс бензилпенициллина натриевой соли кристаллической в той же дозе в течение 14 дней или
- Бензилпенициллина новокаиновая соль по 600 тыс. ЕД в/м два раза в сутки ежедневно в течение 28 дней, через 2 недели - второй курс бензилпенициллина новокаиновой соли в аналогичной дозе в течение 14 дней или
- Прокаин бензилпенициллин по 1,2 млн. ЕД в/м один раз в сутки ежедневно в течение 28 дней, через 2 недели - второй курс прокаин бензилпенициллина в аналогичной дозе в течение 14 дней.
Лечение больных нейросифилисом
Лечение больных ранним нейросифилисом- Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 10 млн. ЕД в/в капельно два раза в сутки ежедневно в течение 14 дней. Разовую дозу антибиотика разводят в 400 мл изотонического раствора натрия хлорида и вводят в/в в течение 1,5-2 ч. (растворы используются сразу после приготовления) или
Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 2-4 млн. ЕД в/в струйно 6 раз в сутки ежедневно (суточная доза 12-24 млн. ЕД) в течение 14 дней. Разовую дозу антибиотика разводят в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида и вводят в/в медленно в течение 3-5 минут в локтевую вену.
Для предотвращения реакции обострения (в виде появления или усугубления неврологической симптоматики) в первые 3 дня пенициллинотерапии можно принимать преднизолон в суточной дозе 50-60 мг (однократно утром).
Через 6 месяцев после окончания лечения проводится контрольное исследование ликвора. При отсутствии его санации курс лечения рекомендуется повторить.
Лечение больных поздним нейросифилисом
Лечение больных поздним нейросифилисом (прогрессирующим параличом, спинной сухоткой) проводится по тем же методикам, которые рекомендованы для лечения больных ранним нейросифилисом. Различие состоит в проведении двух курсов лечения вместо одного, с последующим ликворологическим контролем через 6 месяцев. При отсутствии санации ликвора проводится еще один курс лечения.
При прогрессирующем параличе и спинной сухотке наилучший эффект терапии, как правило, состоит в отсутствии прогрессирования заболевания.
- Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 10 млн. ЕД в/в капельно два раза в сутки ежедневно в течение 14 дней, через две недели - второй курс бензилпенициллина натриевой соли кристаллической в аналогичной дозе в течение 14 дней или
- Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая по 2-4 млн. ЕД в/в струйно 6 раз в сутки ежедневно в течение 14 дней, через 2 недели - второй курс бензилпенициллина натриевой соли кристаллической в аналогичной дозе в течение 14 дней. У больных прогрессирующим параличом для предотвращения обострения психотической симптоматики на фоне специфического лечения в начале терапии показано использование преднизолона.
Лечение сифилиса при указании на непереносимость препаратов пенициллина
При наличии аллергических реакций на пенициллин используются препараты резерва:- Доксициклин по 0,1 г per os 2 раза в сутки ежедневно в течение 10 дней для превентивного лечения, 15 дней - для лечения первичного и 30 дней - для лечения вторичного и раннего скрытого сифилиса или
- Тетрациклин по 0,5 г per os 4 раза в сутки ежедневно в течение 10 дней для превентивного лечения, 15 дней - для лечения первичного и 30 дней - для лечения вторичного и раннего скрытого сифилиса или
- Эритромицин по 0,5 г per os 4 раза в сутки ежедневно в течение 10 дней для превентивного лечения, 15 дней - для лечения первичного и 30 дней - для лечения вторичного и раннего скрытого сифилиса или
- Оксациллина натриевая соль или ампициллина натриевая соль по 1 млн. ЕД в/м 4 раза в сутки (каждые 6 часов) ежедневно в течение 10 дней для превентивного лечения, 14 дней - для лечения первичного и 28 дней - для лечения вторичного и раннего скрытого сифилиса или
- Цефтриаксон по 0,5 г в/м один раз в сутки ежедневно № 5 для превентивного лечения и № 10 - для лечения первичного сифилиса; по 1,0 г в/м один раз в сутки ежедневно № 20 для лечения вторичного и раннего скрытого сифилиса.
Лечение нейросифилиса при указании на непереносимость препаратов пенициллина
Одним из предпочтительных препаратов резерва при нейросифилисе является доксициклин, который применяется перорально по 0,1 г 3 раза в день.Тетрациклин и эритромицин при нейросифилисе применять не рекомендуется, так как они плохо проникают через гематоэнцефалический барьер.
Полусинтетические пенициллины - оксациллин или ампициллин - вводятся внутримышечно по 1 млн. ЕД на инъекцию (доза разводится в 5-6 мл дистиллированной воды) 4 раза в сутки. Длительность лечения - 28 дней.
Цефтриаксон хорошо проникает в органы, ткани и жидкости организма, в частности - в спинномозговую. Кроме того, он обладает высокой трепонемоцидной активностью. При раннем нейросифилисе цефтриаксон назначается по 1,0-2,0 г в/м один раз в сутки ежедневно в течение 20 дней. В тяжелых случаях (сифилитический менингоэнцефалит, острый генерализованный менингит) возможно внутривенное применение препарата и увеличение суточной дозы до 4,0. Для лечения поздних форм нейросифилиса цефтриаксон назначается по 1,0 г в/м один раза в сутки ежедневно в течение 20 дней, через 2 недели - второй курс препарата в аналогичной дозе ежедневно в течение 10 дней.
Дополнительное лечение
Дополнительное лечение показано, если:- через год после полноценного лечения ранних форм сифилиса не произошло 4-х кратного снижения титра MP (RPR);
- имеет место замедленная негативация серологических реакций в течение двух лет без тенденции к дальнейшему снижению титров/степени позитивности теста или
- клинический/серологический рецидив. Проводится однократно или двукратно. Предпочтительно применение: Бензилпенициллина натриевой соли кристаллической по 1 млн. ЕД в/м каждые 4 часа (6 раз в сутки) ежедневно в течение 20 дней или
- Цефтриаксона по 1,0 г в/м один раз в сутки ежедневно в течение 20 дней.
Лечение детей
Специфическое лечение детей, больных ранним врожденным сифилисом- Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая из расчета 100 тыс. ЕД/кг массы тела в сутки в/м, разделенных на 6 инъекций (каждые 4 часа), ежедневно в течение 14 дней или
- Прокаин бензилпенициллин из расчета 50 тыс. ЕД/кг массы тела в сутки в/м один раз в сутки ежедневно в течение 14 дней или
- Бензилпенициллина новокаиновая соль из расчета 50 тыс. ЕД/кг массы тела в сутки в/м, разделенных на две инъекции (каждые 12 часов), ежедневно в течение 14 дней.
Специфическое лечение детей, больных поздним врожденным сифилисом
Бензилпенициллина натриевая соль кристаллическая из расчета 50 тыс. ЕД/кг массы
тела в сутки в/м, разделенных на 6 инъекций (каждые 4 часа), ежедневно в течение 28 дней; через две недели - второй курс бензилпенициллина натриевой соли кристаллической в аналогичной дозе в течение 14 дней или
- Прокаин бензилпенициллин из расчета 50 тыс. ЕД/кг массы тела в сутки в/м один раз в сутки ежедневно в течение 28 дней, через две недели - второй курс прокаин бензилпенициллина в аналогичной дозе в течение 14 дней или
- Бензилпенициллина новокаиновая соль из расчета 50 тыс. ЕД/кг массы тела в сутки в/м, разделенных на две инъекции (каждые 12 часов), в течение 28 дней; через две недели - второй курс бензилпенициллина новокаиновой соли в аналогичной дозе в течение 14 дней.
Профилактические мероприятия при сифилисе
Антенатальная профилактика1. Коррекция полового поведения.
2. Полноценное обследование беременных: сбор анамнеза, клиническое и серологическое исследование в первой и второй половине беременности.
3. Своевременная диагностика и лечение сифилиса у беременных.
Постнатальная профилактика
1. Тщательное обследование новорожденного (до 3-х месячного возраста).
2. Профилактическая терапия - если женщина заранее не получала полноценного лечения, не стоит на учете или не получала профилактику во время беременности.
